ABA抑制气孔发育的分子机制

近日，新加坡国立大学On Sun LAU 课题组在Science Advances在线发表了题为Abscisic acid regulates stomatal production by imprinting a SnRK2 kinase–mediated phosphocode on the master regulator SPEECHLESS的研究论文。该研究发现脱落酸信号通路 （ABA signaling pathway） 的三个核心激酶SnRK2可以通过与气孔发育早期中心转录因子SPEECHLESS (SPCH) 互作，磷酸化SPCH以降低其蛋白水平，从而减少气孔产生。

气孔位于植物表皮层，对植物而言，具有与外界环境进行气体交换 （CO2 uptake and O2 release） 和水分散失的重要功能。在干旱环境中，植物通过增加脱落酸的合成激活脱落酸信号通路中的三个核心激酶SnRK2 （SnRK2.2/SRK2D, SnRK2.3/SRK2I以及SnRK2.6/SRK2E/OPEN STOMATA 1） 以磷酸化离子通道如SLAC1，从而使保卫细胞运动并关闭气孔以减少水分散失。植物在干旱环境下产生的ABA会抑制气孔产生的现象以及ABA合成通路突变体可产生更多气孔的现象已经被报道，然而，ABA如何抑制气孔产生的分子机制仍不清楚。

过去的研究发现snrk2.6单突变体与野生型并没有气孔数量上的区别，从而认为SnRK2.6不参与调控气孔发育。研究者认为snrk2.6单突变体并不具有气孔发育表型可能是因为SnRK2.6与SnRK2.2和SnRK2.3在功能上冗余。通过分析三个SnRK2的单突变体，双突变体以及三突变体的气孔发育表型，研究者发现SnRK2的三突变体具有更多产生气孔的表型 （三突变体气孔多于三个双突变体，三个双突变体气孔多于三个单突变体） ，从而确认SnRK2抑制气孔发育。同时，过表达SnRK2.6可以显著减少气孔产生。此外，外源性脱落酸的添加会抑制气孔的产生，同时该抑制依赖于SnRK2s。

ABA通过SnRK2抑制气孔发育

SnRK2的报告株系证实SnRK2.2和SnRK2.3在气孔发育细胞前体 （stomatal meristemoid） 的细胞核表达，同时与SPCH共定位。而SnRK2.6已知在成熟气孔的保卫细胞表达，而研究者通过观察SnRK2.6的报告株系发现，在气孔发育的早期，SnRK2.6也在气孔发育细胞前体 （stomatal meristemoid） 的细胞核有信号。而只有气孔发育早期启动子（SPCH promoter）表达的SnRK2.6才可以恢复双突变体 （snrk2.2/2.6） 的气孔表型，气孔发育晚期启动子 （FAMA promoter） 表达的SnRK2.6无法恢复双突变体 （snrk2.2/2.6） 的气孔表型，从而证实了SnRK2抑制气孔发育是发生在气孔发育的早期。而气孔发育早期启动子 （SPCH promoter） 表达的SnRK2.6激酶突变体 （通过氨基酸点突变失去其磷酸化功能） 无法恢复双突变体 （snrk2.2/2.6） 的气孔表型验证了SnRK2.6对气孔发育的抑制取决于其作为激酶的磷酸化功能。

SnRK2与SPCH的共定位使研究者推测SnRK2与SPCH可能存在蛋白水平上的互作。而pull-down, BiFc以及免疫共沉淀 （co-IP） 证实了SnRK2与SPCH的互作。通过分析SPCH的氨基酸序列，研究者发现SPCH具有已知的SnRK2磷酸化靶向序列RxxS （S240） 和SxxxxE （S271） ，进一步的LC-MS/MS以及体内和体外的磷酸化实验检测也证实了SPCH的S240和S271是能被SnRK2磷酸化的位点。而对SPCH进行点突变的S240A, S271A, S240/271A （phospho-dead） 报告株系具有相比于野生型报告株系更高的SPCH蛋白水平，而 S240D，S271D （phospho-mimetic） 报告株系的SPCH蛋白水平则低于野生型报告株系。

ABA的短期和长期处理后的气孔表型，荧光信号和Western Blot也证实了丝氨酸S240和S271是SnRK2对于SPCH的磷酸化位点。同时，SPCH-2-4A报告株系 （不受MAPK signaling pathway调控） 在外源ABA处理下蛋白水平仍下降也证实了ABA信号通路负调控SPCH蛋白水平独立于已知的MAPK信号通路 （MAPK signaling pathway） 负调控SPCH蛋白水平。

同时，SPCH-S240/271A （phospho-dead） 会产生更多气孔更易失水而造成对干旱耐受性低于野生型SPCH报告株系，而SPCH-S240D （phospho-mimetic） 产生较少气孔不易失水而对干旱耐受性强于野生型SPCH报告株系。

气孔开闭的检测则证实了SPCH-S240/271A的气孔可以在ABA处理后关闭，并不像SnRK2三突变体 （snrk2.2/2.3/2.6） 一样具有气孔开闭对ABA不敏感的表型，从而验证了SPCH-S240/271A对于干旱的不耐受性是完全由气孔更多造成的失水导致的。

ABA调控气孔发育并影响耐旱性

综上所述，该研究通过遗传和生化等手段将ABA信号通路的三个关键激酶SnRK2与气孔发育早期的核心转录因子SPCH相联系，揭示了ABA抑制气孔形成的分析机制。研究者证实了SnRK2在ABA信号通路中对抗干旱不止于在生理上促进气孔关闭 （作用于成熟气孔的保卫细胞） 而同时在发育上抑制气孔形成 （作用于气孔发育的早期前体细胞） 的功能，反映了SnRK2在生理上和发育上的保守性，一致性以及作用时间的差异性。